Besluit erkenningsvoorwaarden en werkwijzen laboratoria (PPE) 2007

Bederfelijke pluimveeproducten zoals borstvellen en filet dienen gekoeld (1-8 °C) te worden aangeleverd. Zie voor de ontvangst van monsters en registratie van afwijkingen bijlage III.

De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur na monstername op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na het tijdstip van monstername is verstreken.

Stel monsters zo min mogelijk bloot aan temperatuurschommelingen.

Opmerking:

Komen mestmonsters mee met vleesmonsters in een koelbox, sla dan alle monsters gekoeld op. Worden mestmonsters per post ongekoeld verstuurd, sla dan op bij kamertemperatuur, tenzij deze monsters pas de volgende dag worden ingezet.

Voeg zoveel monster toe aan BPw (kamertemperatuur) zodat het monster (minimaal) 1:10 verdund wordt (bijvoorbeeld 25 g monster in 225 ml BPw).

Een ruimere verdunning dan 1:10 is toegestaan, een kleinere verdunning niet.

In Tabel 1 is ter illustratie de relatie tussen de verschillende monsterhoeveelheden en het volume BPw weergegeven:

Ter uitvoering van Verordening (EG) nr. 2160/2003 is in Verordening (EG) nr. 1003/2005 aangegeven dat de monsters van vermeerderingskoppels van Gallus gallus als volgt behandeld dienen te worden:

Inlegvellen van uitkomstladen:

– Plaats de inlegvellen in 1 liter BPw (kamertemperatuur) en schud voorzichtig. Volg verder de procedure vanaf 6.3.

Overschoentjes:

• – Pak het paar overschoentjes zorgvuldig uit om te vermijden dat aanhangend fecaal materiaal loskomt en plaats ze in 225 ml BPw (kamertemperatuur);

• – Bij samenvoegen van vijf paar overschoentjes tot twee monsters: breng vijf afzonderlijke monsters in minimaal 225 ml BPw en zorg ervoor dat alle monsters volledig ondergedompeld zijn;

• – Zwenk om, zodat het monster volledig verzadigd is, en volg verder de procedure vanaf 6.3.

Andere feces (mest) monsters:

• – Breng in het laboratorium elk monster (of verzamelmonster) over in een even groot gewicht BPw en schud voorzichtig;

• – Laat het monster 10-15 min zacht worden en schud voorzichtig;

• – Neem onmiddellijk na het mengen 50 g van het mengsel en voeg dat bij 200 ml BPw (kamertemperatuur). Volg verder de procedure vanaf 6.3.

Opmerking:

Belangrijk is dat de overschoentjes minimaal 1:10 verdund worden in BPw. Bij 1 paar overschoentjes kan 225 ml BPw een grote overmaat zijn. Het is eventueel mogelijk om het paar overschoentjes te wegen en vervolgens zoveel BPw toe te voegen dat de overschoentjes minimaal 1:10 verdund zijn. Bijvoorbeeld als 2 paar overschoentjes 10 g weegt volstaat het om 90 ml BPw toe te voegen (zorg wel dat de monsters volledig ondergedompeld zijn).

Incubeer de BPw 18 uur ± 2 uur bij 37 °C ± 1 °C.

In uitzonderlijke gevallen kan de BPw na incubatie maximaal 2 dagen bewaard worden bij 5 °C ± 3 °C.

Breng 0,1 ml BPw-cultuur op een MSRV plaat (9 cm) door 3 druppels, met een gezamenlijk volume van 0,1 ml, in een driehoek op de MSRV aan te brengen. Incubeer de platen 24 uur ± 3 uur bij 41, 5 °C ± 1 °C.De platen moeten met het deksel van de Petrischaal naar boven geïncubeerd worden, aangezien het een half-vast medium is. Niet verdachte of negatieve platen dienen nogmaals 24 uur ± 3 uur bij 41,5 °C ± 1 °C bebroed te worden.

Een verdachte MSRV-plaat vertoont groei in de agar (zwerming vanuit de entingsplaats) en heeft een wit/grijze kleur.

Verdachte MSRV platen worden afgeënt door aan de rand van de zwermzone met een (1 µl) öse materiaal uit de agar te nemen en daarmee een gedroogde XLD plaat te beënten.

Incubeer de XLD platen gedurende 24 uur ± 3 uur bij 37 °C ± 1 °C.

De meeste Salmonella stammen zijn lactose-negatief en HIS-positief en zijn op Xt-D te herkennen als roze kolonies met een zwart centrum (vaak helemaal zwart). Lactosenegatieve en H₂S-negatieve stammen vormen alleen roze kolonies (zonder zwarting).

Beschouw daarom alle roze kolonies, met en zonder zwart centrum, als verdacht voor Salmonella.

Er zijn ook lactose-positieve en H₂S-positieve Salmonella stammen die op XLD gele kolonies met een zwart centrum vormen en lactose-positieve en H₂S-negatieve stammen die helemaal geel zijn. Deze laatste twee groepen (met gele kolonies) komen bij pluimvee zelden voor.

Voer de bevestiging uit met minimaal 1 tot maximaal 3 specifieke kolonies per plaat in geval van reincultuur en tot 5 specifieke kolonies (indien aanwezig) in geval van mengcultuur totdat een positief resultaat wordt verkregen. De kolonies worden vanaf de XI-D plaat geënt in UA middels het afstrijken op het oppervlak van de agar en in TSI middels ladderen over het schuin gestolde oppervlak en een steekenting tot op de bodem van de buis. Beënt tevens een buis LDC door een hoeveelheid koloniemateriaal tegen de wand van de buis net onder het vloeistofoppervlak af te strijken. De buizen worden 24 uur ± 3 uur bij 37 °C ± 1 °C geïncubeerd.

Opmerking:

Wanneer geen goed losliggende kolonies op de XLD plaat zijn verkregen, of bij de aanwezigheid van veel spreidende of overgroeiende stoorflora, is het nodig ter zuivering een nieuwe reinstrijk op een gedroogde XLD- of nutriëntenagarplaat te maken. Bij verontreiniging van de Salmonella-kolonie met andere bacteriën wordt een afwijkend biochemisch patroon verkregen. Het is toegestaan om eerst de bevestigingstest met de TSI uit te voeren, en bij een verdachte uitslag door te gaan met ureum en LDC.

Na incubatie geven voor Salmonella verdachte kolonies de volgende biochemische resultaten:

Het gebruik van biochemische kits (zoals bijvoorbeeld API of BBI- Crystal) is ook toegestaan.

Alle biochemisch verdachte kolonies dienen geserotypeerd te worden volgens het Kauffmann-White schema. Een toelichting op de serotypering van 6 veel voorkomende Salmonella serotypes is beschreven in PVE-SALMONELLA-SERO-140607.

Voor de serotypering van Salmonella spp. volgens het Kauffmann-White schema (Popoff, 2001) worden door diverse fabrikanten verschillende voorschriften geleverd.

Voor de juiste wijze van typeren dient dan ook altijd het voorschrift van de fabrikant gevolgd te worden.

Details over de taxonomie van Salmonella alsmede over de antigene formules van de Salmonella serotypen staan beschreven in Popoff (2001 ). Onderstaande informatie is een korte toelichting hierop.

De serotypering van Salmonella spp. bestaat uit de volgende stappen:

• – Selectie van een Salmonella verdachte kolonie (vastgesteld middels biochemische typering);

• – Onderzoek naar auto-agglutinatie;

• – Agglutinatie met O-antisera: voor het aantonen van O-antigenen in het Lipopolysaccharide (LPS) van de bacterie;

• – Agglutinatie met H-antisera: voor het aantonen van de H-antigenen in de flagellen van de bacterie.

In het onderstaande stuk wordt de procedure beschreven voor het serotyperen van 6 Salmonella serotypes welke momenteel (2007) regelmatig bij pluimvee worden aangetroffen (zie ook bijlage 1). Deze 6 Salmonella serotypes betreffen:

Salmonella Typhimurium (1, 4, [5], 12 : i : 1, 2)

Salmonella Paratyphi B var. Java (1, 4, [51, 12 : b : 1, 2)

Salmonella Enteritidis (1, 9, 12 : g, m : -)

Salmonella Infantis (6, 7, 14 : r : 1,5)

Salmonella Virchow (6, 7, 14 : r : .1,2)

Salmonella Hadar (6, 8 : zlo : e, n, x)

Kweek een reincultuur van een kolonie welke middels biochemische typering als verdacht voor Salmonella kan worden beschouwd. Gebruik de kweekmethode en het medium zoals voorgeschreven door de fabrikant.

Voer het onderzoek naar auto-agglutinatie uit volgens het voorschrift van de fabrikant. De wijze van onderzoek naar auto-agglutinatie alsmede het aflezen geschiedt op gelijke wijze als de agglutinatie met O-antisera (zie ook 4. Agglutinatie met O-antisera).

Een voorbeeld voor onderzoek naar auto-agglutinatie is hieronder beschreven.

Breng op een objectglas een druppel zoutoplossing (0,85% NaCl);

Breng met een steriele entnaald bacteriemateriaal in de druppel zodat een lichte melkachtige suspensie wordt verkregen;

Beweeg het objectglas heen-en-weer (druppel laten zwenken). De tijd van zwenken varieert per fabrikant van 5 sec tot 60 sec;

Beoordeel de suspensie. De aanwezigheid van klontjes in het preparaat duidt op autoagglutinatie van de onderzochte stam. De stammen die auto-agglutinatie vertonen kunnen niet verder onderzocht worden voor serotypering.

Controleer voor gebruik of de antisera (O en H) helder zijn. Indien troebeling zichtbaar is volg dan de aanwijzingen van de fabrikant.

Opmerking: Bewaar goed getypeerde Salmonella stammen van ringonderzoeken om antisera te testen.

Voor het aantonen van de 6 bovengenoemde Salmonella serotypes worden de volgende O-antisera gebruikt (in volgorde van de hierboven genoemde serotypes):

Begin de agglutinatie met O:4 antiserum. Levert dit een negatief resultaat op, test dan met O:9 antiserum. Levert dit ook een negatief resultaat op test dan met O:7 antiserum. Levert dit ook een negatief resultaat op test dan met O:8 antiserum.

Volg voor de uitvoering en het aflezen van de agglutinatiereactie strikt het voorschrift van de fabrikant.

Een aantal fabrikanten gebruikt een objectglas methode voor het agglutineren. Daarbij wordt een druppel antiserum gemengd met bacteriemateriaal (direct vanaf plaat of vanuit een bacteriesuspensie) op het objectglas, zodanig dat een lichte melkachtige suspensie wordt verkregen. Het objectglas wordt vervolgens heen-en-weer bewogen (druppel laten zwenken).

Vervolgens wordt de reactie afgelezen. De aanwezigheid van klontjes in het preparaat duidt op een positieve reactie. Per fabrikant kunnen o.a. de volgende zaken verschillen:

• – Grootte van de druppel op het objectglas (bijv. ‘25 µl’ of ‘een druppel’);

• – Wijze van opbrengen van antiserum en bacteriemateriaal op het objectglas (bacteriemateriaal direct vanaf agar of via een suspensie toevoegen aan een druppel antiserum op het objectglas of antiserum toevoegen aan een druppel ‘bacteriesuspensie’, op het objectglas);

• – Zwenktijd van het objectglas (kan variëren van 5 sec tot 60 sec);

• – Wijze van aflezen van het resultaat (met blote oog, met vergrootglas, tegen een donkere achtergrond, etc.);

• – Interpretatie van de resultaten (lees met name de voetnoten m.b.t. de beperkingen) .

Na het agglutineren met O-antisera, vindt de agglutinatie met H-antisera plaats.

Salmonella bezit vaak twee typen H-antigeen (fase 1 en fase 2). Indien bij difasische stammen één H-fase negatief wordt gevonden, dient de tweede fase aangetoond te worden middels een fase-inversie methode. Bij fase-inversie wordt het dominante H-antigeen onderdrukt zodat het 2e H-antigeen tot expressie kan komen en kan worden aangetoond.

Het medium dat hiervoor gebruikt wordt dient zodanig te zijn dat Salmonella hier goed in kan bewegen. Een voorbeeld van een dergelijk ‘zwerm medium’ is Sven Gard agar.

Een voorbeeld van een fase inversie methode wordt onder 6. beschreven.

Volg voor zowel het opkweken van de stam als voor het uitvoeren en het aflezen van de agglutinatiereactie met H-antiserum de voorschriften van de fabrikant.

Gebruik de volgende H-antisera voor het aantonen van de 6 hierboven genoemde Salmonella serotypes.

Het hieronder beschreven voorbeeld voor een fase inversie methode betreft de serotypering van Salmonella Typhimurium. In zijn algemeenheid is de methode ook toepasbaar voor andere Salmonella serotypes.

Indien O:4 en H:i positief zijn en H:2 negatief, handel dan als volgt:

Bereid een agarplaat met anti-H:i (bijvoorbeeld Sven Gard serum-mix welke H:i bevat). Ent de stam op het centrum van deze plaat (volg voorschrift van de fabrikant). Agglutineer na incubatie met H:2. Indien dit opnieuw een negatief resultaat oplevert, agglutineer dan opnieuw met H:i. Indien H:i een negatieve of zwakke agglutinatie vertoont dan is het resultaat geen Salmonella Typhimurium. Indien H:i wel een positieve (sterke) agglutinatie vertoont voer dan een tweede fase inversie uit. Bereid hiertoe opnieuw een agarplaat met anti-H:i. Neem bacteriemateriaal van de buitenrand van de eerste fase inversie plaat voor het beënten van de tweede fase inversie plaat. Herhaal de procedure zoals hierboven beschreven.

• Popoff, M.Y, 2001. Antigenic formulas of the Salmonella serovars. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella. Institute Pasteur, Paris, France.

Dit protocol beschrijft een 48-uurs methode voor het aantonen van Salmonella met behulp van de VIDAS SLM test (bio Mérieux) in dons afkomstig van pluimvee.

Salmonella: alle typen Salmonella waarvan zowel O als H antigenen met behulp van de Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) techniek worden aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze.

VIDAS SLM is een enzym immunoassay voor detectie van Salmonella antigenen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de ELFA methode en geautomatiseerd uitgevoerd op het VIDAS analyse apparaat.

De voorophoping en de selectieve ophopingen vinden achtereenvolgens plaats gedurende 18 uur in een voorophopingsmedium, 6-8 uur in 2 verschillende selectieve ophopingsmedia en als laatste gedurende 18 uur in een 3^e ophopingsmedium. Van dit laatste ophopingsmedium wordt een hoeveelheid verhit en in een reagens strip gebracht. De reagens strip wordt in het VIDAS analyse apparaat gebracht, waarna het aantonen van aanwezigheid van Salmonella antigenen met behulp van een cocktail van specifieke monoclonale antilichamen en een fluorescentie reactie volledig geautomatiseerd verloopt. Het test resultaat van deze aantoningsstap is na ca. 45 minuten beschikbaar.

Alle gebruikte grondstoffen en het water moeten van analysekwaliteit zijn.

De samenstelling en bereiding van media en reagentia is opgenomen in bijlage 1 van PVE-SALMONELLA-MSRV-140607 dan wel NEN-EN-ISO 6579: 2002. Er mag echter ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn.

De VIDAS SLM test bestaat uit kant-en-klare reagentia, zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS SLM 30 702 test, instructie van de fabrikant.

Voor algemene eisen en richtlijnen voor microbiologische onderzoeken wordt verder verwezen naar NEN-EN-ISO 7218:2005 Ontw.

De gebruikelijke apparatuur voor een microbiologisch laboratorium en de voor de VIDAS SLM test benodigde apparatuur, zoals onderstaand vermeld:

5.11 Broedstoof voor het bebroeden bij 37°C ± 1 °C

5.12 Broedstoof voor het bebroeden bij 41,5°C ± 1 °C

5.13 Micropipet (500 µl)

5.14 Steriele micropipetpunten

5.15 Waterbad (95-100 °C) of equivalent

5.16 Steriele entnaalden met een oog met een diameter van ca. 3 mm

5.17 Steriele pipetten met een schaalverdeling van 0,1 ml en een meetvolume van 1 ml

5.18 Petrischalen met een middellijn van ca. 9 cm

5.1 9 Cultuurbuizen van 17/18 x 150 mm en van 8 x 160 mm

5.20 Stomacherzakken (met filter)

5.21 VIDAS analyse apparaat

Opmerking:

Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.

De VIDAS SLM test kit bevat een positieve en een negatieve VIDAS reagens controle en een bijbehorende standaard. Deze worden meegenomen in de bepalingen zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS SLM test, instructie van de fabrikant.

Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen:

• – Blanco controle,

• – Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen),

• – Positieve controle.

Geef het resultaat op als ‘Salmonella aangetoond / niet aangetoond in het betreffende monstermateriaal’ als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Bij de uitslag kan tussen haakjes aangegeven worden hoeveel gram monstermateriaal is onderzocht.

Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden (zie bijlage III) dan dient het laboratorium op het analysecertificaat hierover een opmerking te maken en de eventuele gevolgen voor de betrouwbaarheid van de uitslag aan te geven.

• • Gebruiksaanwijzing VIDAS SLM 30 702 test, instructie van de fabrikant.

• • Hartman, E.G., Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faeces m.b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV)-medium, Gezondheidsdienst voor Dieren, projectnr. 401919, september 1999.

• • NEN-EN-ISO 6579:2002. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders – Horizontale methode voor het aantonen van Salmonella spp. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.

• • NEN-EN-ISO 7218:2005 Ontw. En. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders – Algemene eisen en richtlijn voor microbiologische onderzoeken. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.

• • PVE-SALMONELLA-MSRV-140607. PVE Branchemethode voor het aantonen van Salmonella met behulp van MSRV in dons, mest en vlees, afkomstig van pluimvee.

• • Productschap Vee, Vlees en Eieren, Zoetermeer. www.pve.nl PVE-SALMONELLA-SERO-140607. Toelichting op de serotypering van Salmonella volgens het Kauffmann-White schema. Productschap Vee, Vlees en Eieren, Zoetermeer. www.pve.nl bol

• • Van der Zee, H. et al. Validatierapport van de Salmonella bepaling in de matrix dons met behulp van de VIDAS SLM methode. PVE, september 2002.

Dit protocol beschrijft een 24-uurs methode voor het aantonen van Salmonella met behulp van de iQ Check^TMSalmonella kit (Bio-Rad Laboratories b.v.) in dons, mest en vlees afkomstig van pluimvee.

Salmonella: alle typen Salmonella waarvan het DNA aan de hand van de Polymerase Chain Reactie (PCR) wordt aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze.

Uit een voorophopingsmedium wordt, na voorincubatie, het DNA van Salmonella geïsoleerd.

Met behulp van de real-time polymerase chain reaction (PCR) worden Salmonella-specifieke DNA sequenties gelijktijdig vermenigvuldigd en gedetecteerd middels fluorescente probes.

Inclusief voorophoping wordt een positieve of negatieve uitslag verkregen binnen 24 uur.

De samenstelling en bereiding van media en reagentia is opgenomen in bijlage 1. Er mag echter ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn. De iQ Check.^TM Salmonella kit bestaat uit kant-en-klare reagentia.

Alle gebruikte grondstoffen en het water moeten van analysekwaliteit zijn.

Voor algemene eisen en richtlijnen voor microbiologische onderzoeken wordt verder verwezen naar NEN-EN-ISO 7218:2005 Ontw.

De gebruikelijke apparatuur voor een moleculair/microbiologisch laboratorium en de voor de iQ Check^TM Salmonella test benodigde apparatuur en verbruiksmaterialen, zoals onderstaand vermeld:

Opmerking: Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.

Apparatuur

5.1 iCycler Thermal Cycler met 96-wells reactiemodule (Bio-Rad cat. #: 170-8720)

5.2 iCycler iQ Optical Module (Bio-Rad cat. #: 170-8740)

5.3 iCycler iQ Filter set Texas Red/ Rox Dyes (Bio-Rad cat. #: 170-8781)

5.4 Stomacher

5.5 Broedstoof voor het bebroeden bij 37 ± 1 °C

5.6 Verhittingsblok voor 1,5 ml buizen 100 ± 1 °C

5.7 Tafelcentrifuge (maximaal 12.000 rpm, voor 1,5 ml buizen)

5.8 Vortex

5.9 Magnetische roerder

5.10 20 µl, 200 µl and 1000 µl micropipetten

5.11 Combi-tips pipetten

Opmerking: Het gebruik van een universal power source (UPS) in combinatie met de iCycler iQTM wordt aanbevolen. Inmiddels staat ook de Chromo4 Real time PCR machine in de gebruiksaanwijzing vermeld.

Verbruiksmaterialen

5.12 iCycler iQ 96-well PCR platen (Bio-Rad cat. #: 223-9441)

5.13 iCycler iQ Optical sealing tape (Bio-Rad cat. #: 223-9444)

5.14 200 ml 8-strip tubes (Bio-Rad cat. #: 223-9469)

5.15 200 ml 8-strip caps for 200 µl tubes (Bio-Rad cat. #: 223-9472)

5.16 Stomacher zakken met filter

5.17 1 ml en 10 ml pipetten

5.18 Steriele filtertips, passend op 20 µl, 200 µl en 1000 µl micropipetten

5.19 1,5 ml Eppendorf SafeLock buisjes

5.20 Combi-tips tips, steriel, individueel verpakt

5.21 2 ml and 5 ml steriele buizen of flesjes

5.22 Poeder-vrije handschoenen

5.23 Milli-Q of gedestilleerd steriel water

5.24 Ethanol 96% of NaOH 5%

Opmerking:

MLP-9601 PCR plates (Bio-Rad) in combinatie met MSB 1001 Sealing film is ook mogelijk.

De test dient te worden uitgevoerd door op juiste wijze getraind personeel.

Monsters en kweken dienen te worden behandeld en afgevoerd als potentieel infectieus materiaal.

De kwaliteit van de resultaten is afhankelijk van een strikte uitvoering conform Good Laboratory Practice, in het bijzonder aangaande PCR:

• • Gebruik specifieke, gescheiden sets laboratorium benodigdheden zoals pipetten en buizen voor bijvoorbeeld DNA extractie en de bereiding van PCR mix.

• • Het is van groot belang dat gebruik wordt gemaakt van een positieve en negatieve controle in elke serie van amplificatie reacties (‘PCR run’).

• • Gebruik geen reagentia waarvan de houdbaarheidsdatum is verstreken.

• • Homogeniseer reagentia voorafgaand aan gebruik.

• • Controleer regelmatig de nauwkeurigheid en precisie van alle pipetten en apparatuur.

• • Verwissel handschoenen met enige regelmaat, vooral indien contaminatie wordt verondersteld.

• • Voer periodieke reiniging uit van de werkplaats met tenminste 5% bleekmiddel.

• • Vermijdt gebruik van latex handschoenen met poeder. Voorkom vingerafdrukken op het optisch sealing tape.

• • Schrijf niet op de dopjes van PCR-buizen. In beide gevallen zal de real-time dataacquisitie hinder ondervinden.

De iQ Check^TM Salmonella test kit bevat een positieve en een negatieve controle. Een additionele interne controle in elk monster bepaald de efficiëntie van de PCR-reactie en is een indicator voor vals-negatieve reacties. Genoemde controles worden in elke test meegenomen.

Ten behoeve van de validatie van het gehele experiment dienen de controles te voldoen aan de volgende eisen, weergegeven in onderstaande tabel. Is dit niet het geval, dan moet de PCR reactie worden herhaald.

* De software geeft een Ct waarde ‘N/A (not applicable)’ indien de fluorescentie van een monster niet significant boven de achtergrond ruis uitkomt en dus de threshold niet snijdt.

Voor de eerstelijnscontrole van de methode als geheel dienen te worden meegenomen:

• – Blanco controle,

• – Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen),

• – Positieve controle.

Geef het resultaat op als ‘Salmonella aangetoond / niet aangetoond in het betreffende monstermateriaal’ als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Bij de uitslag kan tussen haakjes aangegeven worden hoeveel gram monstermateriaal is onderzocht.

Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden (zie bijlage III), dan dient het laboratorium op het analysecertificaat hierover een opmerking te maken en de eventuele gevolgen voor de betrouwbaarheid van de uitslag aan te geven.

• • AFNOR Validation Certificate, iQ Check^TM Salmonella, attest BRD-07/06-07/04.

• • Gebruiksaanwijzing van de iQ Check^TM Salmonella Test. Bio-Rad Laboratories b.v., 30 augustus 2004, Veenendaal, NL.

• • Miras l., Hermant N., Arricau N., Popoff M.Y. Nucleotide sequence of lagA and lagB genes involved in invasion of HeLa cells by Salmonella enterica subsp. Enterica ser. Typhy. Research in Microbiology, Vol. 146 (1): 17-20 (1995).

• • NEN-EN-ISO 6579:2002. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders – Horizontale methode voor het aantonen van Salmonella spp. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.

• • NEN-EN-ISO 7218:2005 Ontw. En. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders – Algemene eisen en richtlijn voor microbiologische onderzoeken. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.

• • PVE-SALMONELLA-MSRV-140607. PVE Branchemethode voor het aantonen van Salmonella met behulp van MSRV in dons, mest en vlees, afkomstig van pluimvee. Productschap Vee, Vlees en Eieren, Zoetermeer. www.pve.nl

• • PVE-SALMONELLA-SERO-140607. Toelichting op de serotypering van Salmonella volgens het Kauffmann-White schema. Productschap Vee, Vlees en Eieren, Zoetermeer. www.pve.nl

• • Tyagi, S. and Kramer, F.R. Molecular Beacons: Probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology 14: 303-308 (1996).

Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter (in dit protocol verder als Campylobacter aangeduid) in monsters mest en vlees, afkomstig van pluimvee.

Campylobacter: micro-organismen die de voor deze bacteriën karakteristieke groei vertonen en specifieke morfologische, biochemische en serologische reacties vertonen wanneer wordt gekweekt respectievelijk getest volgens de beschreven werkwijze.

Mestmonsters en blindedarm mestmonsters worden rechtstreeks geënt op een selectieve vaste voedingsbodem (mCCDA).

Vlees (bijvoorbeeld vel van de borstkap of filet) wordt in porties van 25 gram gedurende 1 minuut gestomacherd met 100 ml selectief ophopingsmedium (Preston). Hierna wordt het monstermateriaal verwijderd en alleen het ophopingsmedium gedurende 24 uur bebroed bij 41,5 °C. Vervolgens wordt afgeënt op een selectieve vaste voedingsbodem (mCCDA).

Selectieve vaste voedingsbodems worden microaëroob gedurende 48 uur bij 41,5 °C bebroed, waarna beoordeeld wordt op aanwezigheid van specifieke kolonies.

Specifieke kolonies worden bevestigd met behulp van oxidase reactie en microscopie. Als extra controle kan een deel van de isolaten met behulp van een latex agglutinatie test worden bevestigd.

4.4.1 Oxidase reagens

4.4.1.1 Samenstelling

4.4.1.2 Bereiding

Los het N,N,N’,N’-tetramethyl-1,4-fenyleendiammoniumdichloride op in het water. Bereid het reagens vlak voor uitvoering van de oxidasetest.

Dit reagens is ook kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar. Handel dan volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant.

4.4.2 Latexagglutinatietest voor bevestiging van Campylobacter

Latexagglutinatietesten voor bevestiging van thermotolerante Campylobacter zijn commerciëel verkrijgbaar.

Gebruikelijke toestellen en steriel glaswerk voor microbiologische laboratoria en in het bijzonder de onderstaande:

5.1 Broedstoof voor het bebroeden bij 41,5 °C ± 1 °C.

5.2 Suspendeertoestel, Stomacher 5.3 Geschikte apparatuur en hulpmiddelen om te bebroeden in een micro-aërobe atmosfeer (ca. 6% zuurstof, 10% kooldioxide en 84% stikstof). Voor het verkrijgen van microaëroob milieu kan gebruik gemaakt worden van commerciële systemen (‘gas-zakjes’).

5.4 Microscoop, bij voorkeur met fase-contrast, vergroting 1000x.

OPMERKING

Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.

Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen:

• – Blanco controle,

• – Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen),

• – Positieve controle.

Geef het resultaat op als ‘Campylobacter aangetoond / niet aangetoond in het betreffende monstermateriaal’ als Campylobacter al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Bij de uitslag kan tussen haakjes aangegeven worden hoeveel gram monstermateriaal is onderzocht.

Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden (zie bijlage III), dan dient het laboratorium op het analysecertificaat hierover een opmerking te maken en de eventuele gevolgen voor de betrouwbaarheid van de uitslag aan te geven.

• • Jacobs-Reitsma, W. (1994). Epidemiology of Campylobacter in Poultry. Thesis Agricultural University Wageningen, The Netherlands.

• • Jacobs-Reitsma W., M. van der Wal, R. Achterberg and J. Wagenaar. Comparative studies on Campylobacter isolation methods from fresh poultry products. Posterpresentation A-12 at the 12th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms, September 2003, Aarhus, Denmark. Intern. J. of Med. Microbiol., Vol. 293 Suppl. 35, p. 6-7.

• • NEN-EN-ISO 10272:1995. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the detection of thermotolerant Campylobacter + technical corrigenda (ISOIO272:1995/Cor.1:1996(E) and ISO 10272:1995/Cor:1997(E). Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.

• • NEN-EN-ISO 7218:2005 Ontw. En. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - Algemene eisen en richtlijn voor microbiologische onderzoeken. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.

Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter (in dit protocol verder als Campylobacter aangeduid) in vlees, afkomstig van pluimvee.

Campylobacter: alle typen Campylobacter waarvan de specifieke antigenen met behulp van de Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) techniek worden aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze.

VIDAS CAM is een enzym immunoassay voor de detectie van Campylobacter antigenen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de ELFA methode en die geautomatiseerd wordt uitgevoerd op het VIDAS analyse apparaat.

Pluimveevlees (bijvoorbeeld vel van de borstkap of filet) wordt in porties van 25 gram gedurende 1 minuut gestomacherd met 100 ml selectief ophopingsmedium (Preston). Hierna wordt het monstermateriaal verwijderd en alleen het ophopingsmedium gedurende 48 uur bebroed bij 41,5 °C. Vervolgens wordt de VIDAS CAM assay uitgevoerd. Het test resultaat van deze aantoningsstap is na ca. 70 minuten beschikbaar. Verdere bevestiging van positieve uitslagen is niet noodzakelijk.

Gebruikelijke toestellen en steriel glaswerk voor microbiologische laboratoria en in het bijzonder de onderstaande:

5.1 Broedstoof voor het bebroeden bij 41,5 °C ± 1°C.

5.2 Suspendeertoestel, Stomacher

5.3 Geschikte apparatuur en hulpmiddelen om te bebroeden in een micro-aërobe atmosfeer (ca. 6% zuurstof, 10% kooldioxide en 84% stikstof). Voor het verkrijgen van microaëroob milieu kan gebruik gemaakt worden van commerciële systemen (‘gas-zakjes’), bijvoorbeeld:

GenBox micro-aërofiel (10 zakjes, ref. 96125, bioMérieux).

5.4 VIDAS of mini VIDAS analyser (bioMérieux).

5.5 VIDAS CAM assay (30 testen, ref. 30111, bioMérieux)

OPMERKING

Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.

Bederfelijke pluimveeproducten zoals borstvellen en filet dienen gekoeld (1-8 °C) te worden aangeleverd. Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage III.

De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur na monstername op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na het tijdstip van monstername is verstreken.

Campylobacter is zeer gevoelig voor invriezen en daarom is het invriezen van monsters niet toegestaan.

De in dit voorschrift beschreven VIDAS CAM methode is een detectie methode. Verdere confirmaties zijn niet nodig.

De VIDAS CAM test kit bevat een positieve en een negatieve VIDAS reagens controle en een bijbehorende standaard. Deze worden meegenomen in de bepalingen zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS CAM test.

Voor de eerstelijnscontrole van de methode als geheel dienen te worden meegenomen:

• – Blanco controle,

• – Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen),

• – Positieve controle.

Geef het resultaat op als ‘Campylobacter aangetoond / niet aangetoond in het betreffende monstermateriaal’ als Campylobacter al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Bij de uitslag kan tussen haakjes aangegeven worden hoeveel gram monstermateriaal is onderzocht.

Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden (zie bijlage III), dan dient het laboratorium op het analysecertificaat hierover een opmerking te maken en de eventuele gevolgen voor de betrouwbaarheid van de uitslag aan te geven.

• • Jacobs-Reitsma, W., M. van der Wal, E. Samuëls and J. Wagenaar. Evaluation of the VIDAS Campylobacter Assay for detection of Campylobacter in fresh poultry products after various enrichment methods. Posterpresentation A-18 at 12th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms, September 2003, Aarhus, Denmark. Intern. J. Med. Microbiol., Vol. 293 Suppl. 35, p. 6.

• • Jacobs-Reitsma, W., M. van der Wal, R. Achterberg, J. Wagenaar. Comparative studies on Campylobacter isolation methods from fresh poultry products. Posterpresentation A-21 at 12th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms, September 2003, Aarhus, Denmark. Intern. J. Med. Microbiol., Vol. 293 Suppl. 35, p. 6-7.

• • NEN-EN-ISO 7218:2005 Ontw. En. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - Algemene eisen en richtlijn voor microbiologische onderzoeken. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft.

• • PVE-CAMPYLOBACTER-140607. PVE Branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter met behulp van Preston en CCDA in mest en vlees, afkomstig van pluimvee. Productschap Vee, Vlees en Eieren, Zoetermeer. www.pve.nl

• • Samuëls, E.L.A.M. en W. Jacobs-Reitsma, Validatierapport van de Campylobacter bepaling in de matrix pluimveevlees met behulp van de VIDAS CAM methode. (Onderzoek in het kader van het PVE Plan van Aanpak/Actieplan 2000 + Salmonella en Campylobacter in de pluimveesector), april 2004.